Admin血凝分析仪
血栓与止血是一门新兴的边缘学科,涉及基础医学及预防医学的各个领域。 在血栓/止血实验室中最基本的设备就是血液凝固分析仪(以下简称血凝仪)。利用血凝仪进行血栓与止血的实验室检查,可为出血性和血栓性疾病的诊断、溶栓以及抗凝治疗的监测及疗效观察提供了有价值的指标。随着科学技术的日新月异,血栓与止血的检测从传统的手工方法发展到全自动血凝仪,从单一的凝固法发展到免疫法和生物化学法,血栓与止血的检测也因此变得简便、迅速、准确、可靠。
目
录
1发展概况
2基本原理
血栓/止血成份检测方法
3基本结构
4检测项目
5发展应用
6具体实例
1 发展概况
1910年Kottman发明了世界上最聚早的血凝仪,通过测定血液凝固时的粘度的变化来反应血浆凝固的时间。
1922年,Kugelmass用浊度计通过测定透射光的变化来反应血浆凝固时间。
1950年,Schnitger和Gross发明了基于电流法的血凝仪。
60年代,机械法血凝仪得到开发。
70年代以后,由于机械、电子工业的发展,使各种类型的全自动血凝仪先后问世。
80年代,由于发色底物的出现并应用于血液凝固的检测,使全自动血凝仪除了可以进行一般的筛选试验外,尚可以进行凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统单个因子的检测。
80年代末,双磁路磁珠法的发明给血栓与止血的检测带来新概念,由于其独特的设计原理,使光学法检测的一些影响因素在本类型的检测仪器上均不复存在。
90年代,全自动血凝仪免疫通道的开发又为血栓与止血的检测提供了新的手段。
2 基本原理
目前可开展的血栓/止血成份检测方法,主要方法有凝固法、底物显色法、免疫法、乳胶凝集法等。在表中可注意到,在血栓/止血检验中最常用的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶时间(TT)、内源凝血因子、外源凝血因子、高分子量肝素、低分子量肝素、蛋白C、蛋白S等均可用凝固法测量。所以目前半自动血凝仪基本上都是以凝固法测量为主,而在全自动血凝仪中也一定有凝固法测量。
凝固法中又可分为光学法和磁珠法两类。由于光学法几乎可涵盖各种检测方法,为了降低仪器制造成本,全自动血凝仪以光学法居多。但也有少数高级全自动血凝仪中凝固法测量采用无样品干扰的双磁路磁珠法,而其它测量采用光学法,并可同时进行检测。
血栓/止血成份检测方法
(一) 凝固法(生物物理法)
凝固法是通过检测血浆在凝血激活剂作用下的一系列物理量的变化(光、电、机械运动等),由计算机分析所得数据并将之换算成最终结果,所以也可将其称作生物物理法。
1. 电流法
电流法利用纤维蛋白原无导电性而纤维蛋白具有导电性的特点,将待测样品作为电路的一部分,根据凝血过程中电路电流的变化来判断纤维蛋白的形成。
由于该电流法的不可靠性及单一性,很快被更灵敏、更易扩展的光学法所淘汰。
2. 光学法(比浊法)
光学式血凝仪是根据凝固过程中浊度的变化来测定凝血的。根据不同的光学测量原理,又可分为散射比浊法和透射比浊法两类。
(1)散射比浊法:散射比浊法是根据待验样品在凝固过程中散射光的变化来确定检测终点的。在该方法中检测通道的单色光源与光探测器呈90°直角,当向样品中加入凝血激活剂后,随着样品中纤维蛋白凝块的形成过程,样品的散射光强度逐步增加,仪器把这种光学变化描绘成凝固曲线,当样品完全凝固以后,散射光的强度不再变化。通常是把凝固的起始点作为0%,凝固终点作为100%,把50%作为凝固时间。光探测器接收这一光的变化,将其转化为电信号,经过放大再被传送到监测器上进行处理,描出凝固曲线。当测定含有干扰物(高脂血症、黄疸和溶血)或低纤维蛋白原血症的特殊样本时,由于本底浊度的存在,其作为起始点0%的基线会随之上移或下移,仪器在数据处理过程中用本底扣除的方法来减少了这类标本对测定的影响。但是这是以牺牲有效信号的动态范围为代价的,对于高浊度标本并不能有效解决问题。
(2)透射比浊法:透射比浊法是根据待测样品在凝固过程中吸光度的变化来确定凝固终点。与散射比浊法不同的是该方法的光路同一般的比色法一样呈直线安排:来自光源的光线经过处理后变成平行光,透过待测样品后照射到光电管变成电信号,经过放大后在监测器处理。当向样品中加入凝血激活剂后,开始的吸光度非常弱,随着反应管中纤维蛋白凝块的形成,标本吸光度也逐渐增强,当凝块完全形成后,吸光度趋于恒定。血凝仪可以自动描记吸光度的变化并绘制曲线,设定其中某一点对应的时间为凝固时间。
就浊度测量原理而言,散射比浊法更为合理、准确。在这类仪器中,光源、样品、接收器成直角排列,接收器得到的完全是浊度测量所需的散射光。
而在透射比浊法中,光源、样品、接收器成一直线排列,接收器得到的是很强的透射光和较弱的散射光,前者是有效成份,后者应扣除,所以要进行信号校正,并按经验公式换算到散射浊度。此法虽仪器简单,但精度较差。
3 . 双磁路磁珠法
早期的是在检测杯中放一粒磁珠,与杯外一根铁磁金属杆紧贴呈直线状,标本凝固后,由于纤维蛋白的形成,使磁珠移位而偏离金属杆,仪器据此检测出凝固终点。这类仪器也可称为平面磁珠法。早期的平面磁珠法虽能有效克服光学法中样品本底干扰的问题,但也存在着灵敏度低等问题。
现代磁珠法在八十年代末提出、九十年代初商品化。现代磁珠法曾形象地称为摆动磁珠法,不过双磁路磁珠法的名称更为确切。
双磁路磁珠法的测试原理:测试杯两侧的有一组驱动线圈,它们产生恒定的交替电磁场,使测试杯内特制的去磁小钢珠保持等幅振荡运动。凝血激活剂加入后,随着纤维蛋白的产生增多,血浆的粘稠度增加,小钢珠的运动振幅逐渐减弱,仪器根据另一组测量线圈感应到小钢珠运动的变化,当运动幅度衰减到50%时确定凝固终点。
双磁路磁珠法进行凝血测试,完全不受溶血、黄疸及高血脂症的影响,甚至加样中产生气泡也不会影响测试结果。
光学法血凝仪的试剂用量只有手工测量的一半。而磁珠法的试剂用量只有光学法的一半!这是因为在比浊测定过程中,激发光束必须打在测试杯的中间,所以要有足够的试剂量。在双磁路磁珠法测量中,钢珠在测试杯的底部运动,因此试剂只要覆盖钢珠运动即可。
双磁路磁珠法中的测试杯和钢珠都是专利技术,有特殊要求。测试杯底部的弧线设计与磁路相关,直接影响测试灵敏度。小钢珠经过多道工艺特殊处理,完全去掉磁性。在使用过程中,加珠器应远离磁场,避免钢珠磁化。为了保证测量的正确性,钢珠应当一次性使用。
血凝仪的测量过程中,充分搅拌至关重要,这对于凝血过程的描述和凝固终点的判断都会有很大帮助,CV会有很大改进。在仪器中常用磁珠搅拌或离心方式来达到目的。现在有相当一部分光学式半自动血凝仪采用磁珠搅拌。有人误以为这就是磁珠法。实际上,以测量吸光度变化来研究凝血过程的,其实质都属于光学比浊法。例如“光电磁珠法”、“光电电磁法”等,都回避不了光学法的缺陷。
如果把测试杯用墨涂黑,那么在磁珠法血凝仪中仍可测量,而在光学法血凝仪则是“一团漆黑”,无法测量了。至此,也就容易理解为何双磁路磁珠法样品的黄疸、溶血等混浊的影响。
由于磁珠法中测量的是磁电信号,对测试杯无任何光学要求,所以测试杯可反复清洗使用。而光学比浊法中,测试杯不能有擦痕,一般不宜重复使用。
(二)底物显色法(生物化学法)
底物显色法通过测定产色底物的吸光度变化来推测所测物质的含量和活性的,该方法又可称为生物化学法。检测通道由一个卤素灯为检测光源,波长一般为405nm。探测器与光源呈直线,与比色计相仿。
凝血仪使用产色底物检测血栓与止血指标的原理是:通过人工合成与天然凝血因子有相似的一段氨基酸排列顺序并还有特定作用位点的小肽,并将可水解产色的化学基因与作用位点的氨基酸相连。测定时由于凝血因子具有蛋白不解酶的活性,它不仅作用于天然蛋白质肽链,也能作用于人工合成的肽段底物,从而释放出产色基因,使溶液呈色。产生颜色的深浅与凝血因子活性成比例关系,故可进行精确的定量。目前人工合成的多肽底物有几十种,而最常用的是对硝基苯胺(PNA),呈黄色,可用405mm波长进行测定。
底物显色法灵敏度高、精密度好,而且易于自动化,为血栓/止血检测开辟了新途径。
底物显色法通常使用以下三种形式:
a) 先将被检血浆中的某种酶加以激活,然后由此活化的凝血因子对人工合成的底物进行水解而呈色,如纤溶酶原,蛋白C测定等。
b) 向被检血浆中加入过量的有关试剂,以中和相应的抗凝因子,然后测定其残余的酶活性,如AT-活性测定,α2-抗纤溶酶测定,肝素测定等。
以测定抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)为例,在反应体系中加入过量的凝血酶,后者与血浆中的AT-Ⅲ形成1:1复合物,剩余凝血酶作用于合成的凝血酶底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-PNA·2Hcl),释放出显色基团PNA,显色反应的深浅与剩余凝血酶的量呈正相关,而与AT-Ⅲ的活性呈负相关。
c) 直接测定被检血浆中某种蛋白水解酶的活性,如凝血酶,Xa,尿激酶测定等。
(三)免疫学方法
在免疫学方法中以纯化的被检物质为抗原,制备相应的抗体,然后用抗原抗体反应对被检物进行定性和定量测定。
常用方法有:
1.免疫扩散法 将被检物与相应抗体在一定的介质中结合,测定其沉淀环的大小,与标准进行比较,计算待测物的浓度。此法操作简单,不需特殊设备,但耗时过长,且灵敏度不高,仅适于含量较高的凝血因子的检测。
2. 火箭电泳 在一定电场中,凝胶支持物内的被检测与其相应抗体结合形成的一个个“火箭峰”,火箭峰的高度与其含量成正比,通过测定峰高并与标准比较而进行定量测定。此法操作复杂,临床应用较少。
3.双向免疫电泳 通过水平与垂直两个方向进行电泳可将某些分子结构异常的凝血因子进行分离。
4. 酶联免疫吸附试验(ELISA法)用酶标抗原或抗体和被检物进行抗原结合反应,经过洗涤除去未结合的抗原或抗体及标本中的干扰物质,留下固定在管壁的抗原抗体复合物,然后加入酶的底物和色原性物质,反应产生有色物质,用酶标仪进行测定,颜色的深浅与被检物浓度呈比例关系。该法灵敏度高,特异强,目前已用于许多止血、血栓成分的检测。
5.免疫比浊法 将被检物与其相应抗体混合形成复合物,从而产生足够大的沉淀颗粒,通过透射比浊或散射比浊进行测定。此法操作简便,准确性好,便于自动化。
免疫比浊法可分为直接浊度法分析和乳胶比浊法分析。直接浊度分析既可通过透射比浊,也可通过散射比浊。
透射比浊是指凝血仪光源的光线通过待检样本时,由于待检样本中的抗原与其对应的抗体反应形成抗原-抗体复合物,使透过的光强度减弱,其减弱程度与抗原量成一定的数量关系,通过这一点可从透过光强度的变化来求得抗原的量。
散射比浊法指凝血仪光源的光通过待测样本时,由于其中的抗原与特异的抗体形成抗原-抗体复合物,使溶质颗粒增大,光散射增强。散射光强度的变化与抗原的量呈一定的数量关系,通过这一点可从散射光强度的变化来求得抗原含量。
另一种是乳胶比浊法,即将将待检物质相对应的抗体包被在直径为15～60nm的乳胶颗粒上,然后与被检物结合,形成抗原抗体的复合物的乳胶颗粒凝集,体积增大,使透射光和散射光的变化更为显著,从而提高实验的灵敏性。用仪器或肉眼进行定量或半定量分析。目前,多用于FDP和D-二聚体的检测。
3 基本结构
血凝仪按自动化程度可分为半自动化及全自动化,前者主要检测一般常规凝血项目,后者则有自动吸样、稀释样品、检测、结果储存、数据传输、结果打印、质量控制等功能,除对凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统功能进行全面的检测,尚能对抗凝、溶栓治疗进行实验室监测。
(1) 半自动血凝仪
目前市售的半自动血凝仪主要由样品、试剂预温槽、加样器、检测系统(光学、磁场)及微机组成。有的半自动仪器还配备了发色检测通道,使该类仪器同时具备了检测抗凝及纤维蛋白溶解系统活性的功能。
针对光学式半自动血凝仪受人为的因素影响多、重复性较差等缺陷,仪器中应有自动计时装置,以告知预温时间和最佳试剂添加时间;在测试位添加了试剂感应器,后者感应从移液器针头滴下的试剂后自动振动,使反应过程中血浆与试剂得以很好地混合;此外,该类仪器在测试杯顶部安装了移液器导板,在添加试剂时由导板来固定移液器针头,从而保证了每次均可以在固定的最佳的角度添加试剂并可以防止气泡产生。这一系列改进,提高了光学式半自动血凝仪检测的准确性。
一般半自动血凝仪都可进行凝固法测试,而需要用其它测试方法实现的凝血项目则可用生化分析仪、酶标仪等进行。
(2) 全自动血凝仪
该类仪器的基本构成包括:样品传送及处理装置、试剂冷藏位、样品及试剂分配系统、检测系统、电子计算机、输出设备及附件等。
1. 样品传送及处理装置 一般血浆样品由传送装置依此向吸样针位置移动,多数仪器还设置了急诊位置,可以使常规标本检测必要时暂停以服从免疫比浊法 将被检物与其相应抗体混合形成复合物,而产生足够大的沉淀颗粒,通过透射比法或散射比浊进行测定。此法操作简便,准确性好,便于自动化。
免疫比浊法可分为直接浊度法分析和乳胶比浊法分析。 直接浊度分析既可通过透射比浊,也可通过散射比浊。透射击比浊法是指凝血仪光源的光线通过待检样本时,由于待检样本中的抗原与其对应的抗体反应形成抗原-抗菌素体复合物,使透过的光强度减弱,其减弱程度与抗原量成一定的数量关系,通过这一点可从透过光强度的变化来求得抗原的量。
散射比浊法指凝血仪光源的光通过待测样本时,由于其中的抗原与特异的抗体形成抗原-抗体复合物,使溶质颗粒增大,光散射增强。散射光强度的变化与抗原的量呈一定的数量关系,通过这一点可从散射光强度的变化来求得抗原含量。
另一种是乳胶比浊法,即将待检物质相对应的抗体包被在直径为15~60nm的乳胶颗粒上,然后与被检物结合,形成抗原抗体的复合物的乳胶颗粒凝集团,体积增大,使透射光和散射光的变化更为显著,从而提高实验的灵敏性。用仪器或肉眼进行定量或半定量分析。目前,多用于FDP和D-二聚体的检测。
急诊标本的优先测定。样品处理装置由标本预温盘及吸样针构成,前者可以放置几十份血浆样品。吸样针将血浆标本吸取后放于预温盘的测试杯中,可供重复测试,自动再稀释和连锁测试之用。
2. 试剂冷藏位 为避免试剂的变质,仪器往往有试剂冷藏功能,一般同时可以放置几十种试剂进行冷藏。
3. 样品及试剂分配系统 样品臂会自动提起标本盘中的测试杯,将其置于样品预温槽中进行预温。然后试剂臂将试剂注入测试杯中(性能优越的全自动血凝仪为避免凝血酶对其他检测试剂的污染,有独立的凝血酶吸样针),带有旋涡混合器的装置将试剂与样品进行充分混合后将送至测试位,经检测的测试杯被该装置自动丢弃于特设的废物箱中。
4.检测系统 这是涉及仪器测量原理的关键部分。检测血浆的凝固可以通过凝固反应检测法检测,即当纤维蛋白凝块形成时,检测散射光在660nm处浑浊液吸光度的变化;或通过凝固点检测法检测,即计算达到预先设定好的吸光度值时的凝固时间;而磁珠法则是通过测定在一定磁场强度下小钢珠的摆动幅度变化来测定血浆凝固点。发色底物法及免疫法是检测反应液在405nm、575nm及800nm时的吸光度变化来反映被检测物质的活性。
5. 电子计算机 根据设定的程序计算机指挥血凝仪进行工作并将检测得到的数据进行分析处理,最终得到测试结果。计算机尚可对患者的检验结果进行储存,记忆操作过程中的各种失误,及进行质量有关的工作。
6. 输出设备 通过计算机屏幕或打印机输出测试结果。
7. 附件 主要有系统附件、穿盖系统、条码扫描仪、阳性样品分析扫描仪等。
现代全自动血凝仪有以下一些性能特点,使它在临床应用中日益受到欢迎:测速度快、检测项目齐全 目前广泛使用的的检测速度多在50～300测试/小时,较快的可达700测试/小时;检测的项目除常规的凝血筛选实验外,可进行单个凝血抗凝、纤溶系统因子的检测,也可以进行抗凝及溶栓疗法的监测。
活性与抗原性同时检测 目前有的全自动血凝仪除了利用血浆凝固法和显色底物法进行有关因子活性检测外,尚可利用免疫比浊的原理进行这些因子的抗原含量测定。
检测通道、同时检测项目 性能优越的血凝仪有 多个检测通道,同时检测的项目可以多达10个。
标本及试剂位 全自动血凝仪一般有超过50个标本位,有的尚设有急诊位可以使紧急标本优先检测。条形码的运用使仪器对标本及所需检测项目进行快速识别。性能优越的血凝仪设有几十个15℃的试剂位,可以满足多个检测同时进行的需求。由于配备了盖帽贯穿式进样机,有的仪器检测时可以不打开样品管,从而使检测的自动化又有提高。
平行线生物学分析功能 有的血凝仪可以进行全自动多浓度稀释分析,根据与标准曲线呈平行状态的平行线图象来显示不同稀释浓度的测试结果。
自动重检、连锁功能 当检测结果异常时,有的全自动血凝仪可以根据先前的设定,自动对样品进行稀释重检或不稀释重检,并进行自动连锁筛选实验。如当APTT检测结果异常时,仪器可以自动进行重检,结果如仍然异常,血凝仪自动进行PT测定,若结果正常,根据设定,仪器可以自动检测FⅧ: C、FIX:C、FXI:C或FⅫ:C;若PT的结果亦为异常,仪器可以自动检测Fib的含量。 质量控制 有些全自动血凝仪拥有10组各2个质控文件,1个为现用质控文件,另一个是新批号质控文件,以全面支持实验室质控要求。在均数或L-J之外,有的全自动血凝仪还另外附加了一种新型的多规则质控方法(Westgard),从而为检验提供具有高可靠性的测试结果。
结果的储存、传递 计算机技术的应用使仪器可以进行大量检测数据的储存,通过特定的接口可以使检验结果迅速传递到各临床科室。
科研通道 目前较高级的血凝仪均为用户设计了科研通道,使其应用范围得以扩大。开放的试剂系统 根据我国的国情,许多仪器厂商在血凝仪上设置了开放的试剂检测系统,以使用户可以灵活选用不同试剂进行检测。
4 检测项目
目前的半自动血凝仪以凝固法测定为主,而全自动血凝分析仪可以进行凝血、抗凝和纤维蛋白溶解系统功能的测定。
1. 凝血系统 可以进行凝血系统的筛选实验:如凝血酶原时间(PT)、活化的部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)测定;也能进行单个凝血因子含量或活性的测定,2. 如纤维蛋白原(FIB)、凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ。
3. 抗凝系统 可进行抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、蛋白C(PC)、蛋白S(PS)、抗活化蛋白C(APCR)、狼疮抗凝物质(LAC)等测定。
4. 纤维蛋白溶解系统 可测定纤溶酶原(PLG)、α2-抗纤溶酶(α2-AP)、FDP、D-二聚体(D-Dimer) 等。
5. 临床用药的检测 当临床应用普通肝素(UFH)、低分子肝素(LMWH)及口服6. 抗凝剂如华发灵时,7. 可用血凝分析仪进行监测以保用药安全。
5 发展应用
血凝仪的发展较生化分析仪为短,70年代凝血因子的活性检测方法问世,80年代发色底物技术的广泛运用使抗凝、纤溶的检测成为可能,近年来,血凝仪普遍安装了免疫比浊技术通道及软件,结果使血栓与止血的自动化检测日臻完善;同时由于全自动血凝仪检测的快速、简便、结果准确及精密度高等特点,极大地提高了检测的速度及质量。
血凝仪的发展方向与全自动生化分析仪一样——进一步提高仪器的检测的自动化程度,如将自动离心机处理的标本通过传输装置运至全自动血凝仪;ID条形码识别装置识别样本,根据不同的测试要求对样品进行分配,由盖帽贯穿式进样机吸样后血凝仪自动进行检测,计算机对结果进行分析、报告并传输至指定场所;提高仪器检测的灵敏度与特异性,使检测结果更符合检测实际;逐步缩小不同仪器检测结果的差异,增强检测结果的可比性,进一步完善检测的标准化;建立血凝检测的网络化,使同一患者在不同的医疗单位的检测结果可以交互使用,有利于减轻患者的负担及疗效的判断;对于在中国销售的血凝仪,应促使生产厂实现人机操作界面的汉化,以利于血栓与止血检测的自动化的普及和提高。
6 具体实例
HF-6000血凝分析仪
◆蓝屏带背光,320*240大屏幕液晶显示器
◆加样自动触发测量,操作简便,人机对话
◆通过RS-232串口通讯接口可与计算机进行数据交换
◆内置育温计时器,育温时间到后时光提示
◆自动打印实时报告、综合报告及医学项目参考值
◆抗干扰能力强,消除黄疸、溶血、乳糜、浑浊等干扰
◆结果准确,重复性好
◆纤维蛋白原检测线性范围宽
◆分析方法为光电磁珠
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